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菌落总数测定操作步骤及注意事项
作者: 陈工 编辑: 小贝 来源: 内部 发布日期: 2022.02.28
信息摘要:
一、测定标准      参考食品国家标准:GB 4789.2-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》。

一、测定标准

      参考食品国家标准:GB 4789.2-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》。


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二、操作过程

 1、前期准备:

      根据国家标准,提前准备好要用的平板计数琼脂、平皿、试管、稀释液(生理盐水)、三角烧瓶等,相应的材料进行灭菌处理(干热灭菌或高压灭菌)。

2、接收样品:

      收到样品后,确认样品包装是否完好,登记样品信息,并将其保存在2~8℃冰箱中,然后在取样时取出。

3、样品处理:

      按照作业指导书操作,仔细阅读实验要求。一般实验室收到的是干粉样品、固体样品、或者液体样品等。假如收到干粉样品,那么首先需要将其配置成水溶液(即水化)。根据实验要求及经验,进行预判,预估稀释液倍数,溶解即可。

4、实验前准备:

       4.1实验操作最好在超净台或者生物安全柜里操作,需要把超净台或者生物安全柜提前清理、消毒处理,确保实验环境无菌。

       4.2提前把要用到的平皿、试管、稀释液等放到操作台上紫外杀菌。

5、实验操作:

      5.1稀释

      将样品从冰箱中取出达到室温后开始取样,在超洁净台或者生物安全柜下先用少许稀释液(选取的生理盐水)进行水化后吸入无菌瓶或袋中,再用剩余的稀释液进行洗涤并全部转入无菌瓶或袋中。

      洗涤转移时注意样品瓶盖的清洗和无菌操作,将全部的水化液进行均质混匀,一般作为原液立刻进行接种;再取25ml到225ml稀释液中均质混匀,制成10-1梯度样品匀液。

用1ml无菌吸管取1:10的样液到9ml生理盐水试管中,制成1:100的样液,以此类推。再将几个稀释度的样液接种到提前做好标记的无菌平皿中。

      5.2倾注平板

      将提前在水浴锅里凉至46℃的平板计数营养琼脂培养基注入平皿约15ml,并转动平皿,混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液(不含样品)的灭菌平皿内作空白对照。倾注过程一般左手拿平皿,右手拿琼脂瓶,左手将平皿打开30°左右的缝隙,倾注琼脂大约到平皿底的二分之一处,左三圈、右三圈轻轻混匀,然后放到台面上。待琼脂凝固后,翻转平板,置36±1℃温箱内培养48±2h。

     5.3观察计数

      24h观察检测结果有无异常现象,是否有蔓延菌落出现。48h再按照GB 4789.2的要求进行菌落计数。在对结果进行分析后,选取检测结果的平均值为最终数据。

三、注意事项

1、当无法预判样品菌落总数含量时,需要梯度稀释,此步骤尤其关键,必须尽可能地减少误差。

2、倾注用培养基应在46℃水浴内保温,温度过高会影响细菌生长,过低琼脂易凝固,不能与菌液充分混匀。如无水浴条件,应以皮肤感受较热而不烫为宜。

3、倾注培养基的量规定不一,从12~20ml不等,一般以15ml较为适宜,平板过厚会影响观察,太薄又易于干裂。倾注时,培基底部如有沉淀物,应将底部弃去,以免与菌落混淆而影响计数观察。

4、倾注过程力度一定掌握好,绝不能把琼脂溅出来。

5、为使菌落能在平板上均匀分布,检液加入平皿时要尽可能放在中央部位,然后应尽快倾注培养基并旋转混匀,可正反两个方向旋转,检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不易过长,以防止细菌有所死亡或繁殖。

6、琼脂培养基放水浴锅前一定要混合均匀,以防出现平皿不凝固现象;拿出倾注时要用喷有75%酒精的抹布擦拭干净。

7、冷却的过程不要着急,冷却充分后再倒置放进培养箱培养,放置的时候要尽量避免放到风机口处,每摞不要超过6个平皿。

8、检测结束后所有的稀释液样品可放到冰箱里0-5℃冷藏,以备实验出错时再用。

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